Diseño racional de la endolisina quimérica PCNP-KZ144 con potencial frente a bacterias gram-negativas.

Abstract

El creciente problema de la resistencia bacteriana unido a las restricciones en el uso de antibióticos, ha conducido hacia la evaluación de las endolisinas fágicas como un potencial agente que coadyuve con el uso de los antibióticos para el control de múltiples bacterias patógenas, principalmente de tipo Gram-positivas. Sin embargo, debido a las limitaciones que poseen contra bacterias Gram-negativas por la baja permeabilidad de su membrana externa, se ha propuesto el desarrollo de diferentes estrategias, entre las que destacan las endolisinas “quiméricas” para mediar el paso por la membrana externa y acceder a la pared celular. El objetivo de este trabajo, fue obtener una variante quimérica de la endolisina KZ144 con capacidad bactericida contra V. parahaemolyticus. La endolisina KZ144 es una enzima codificada por el gen 144 del bacteriófago fKZ, que infecta a la bacteria Gramnegativa Pseudomonas aeruginosa, la cual tiene capacidad enzimática en condiciones marinas. La estrategia consistió en fusionar en su extremo N-terminal, un nanopéptido policatiónico (PCNP) con capacidad de desestabilizar la membrana externa de bacterias Gram-negativas, manteniéndose estable a altas concentraciones de NaCl y en un amplio intervalo de pH. Se realizó un modelado tridimensional de la endolisina quimérica (denominada PCNP-KZ144), empleando diversas herramientas bioinformáticas. El análisis in silico mostró que la fusión no afectaría negativamente el plegamiento o la actividad de la endolisina. Posteriormente se procedió al diseño de la construcción. El gen sintético fue clonado en el vector de propagación pJET1.2, y subclonado en el vector de expresión pColdI, obteniéndose la construcción PCNP-KZ144+pColdI.