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Título : Aislamiento, purificación y caracterización de la estructura proteica paraesporal asociada a apéndices presentes en la cepa Bt1-88
Autor : Dra. Rojas Avelizapa, Luz Irene
Dr. Cruz Camarillo, Ramón
M. en C. VENTURA SUAREZ, ANTONIO
Palabras clave : paraesporal
Bt1-88
apéndices
cepa
Fecha de publicación : 20-jun-2011
Resumen : Bacillus thuringiensis produces along its stationary phase of growth, small intracelular proteinic inclusions commonly named crystals, whose size and shape may be variable. By considering its location at one end of the spore, such bodies are as well know as parasporal proteinic inclusions (PPI) , which have larvicidal activity on certain specific plague-insects. For this reason, such PPI has been used around the world to formulate commercial bioinsecticides. However, an atypical novel strain known as Bt2- 56 was isolated recently. Such bacterium had its spore joined to a very long filament, which in turn was linked through its other end to a large cubic PPI. Even more recently, another novel strain of B. thuringiensis, named Bt1-88 which is the central point of the present research, shows close to one end of its spore, a very small flat hexagonal PPI, with six appendages. The nascent portion of these six appendages is closely attached to the six vertices of the parasporal bodies. The presence of PPI associated to one or more appendages could represent a new phenotypic class of B. thuringiensis. The aim of the present research was to carry out new studies on the Bt1-88 strain of B. thuringiensis. Thus, it was found that the size of its hexagonal PPI was 479±67.5 nm. Besides, it was composed by three different proteins, whose molecular weights corresponded to 30, 60 and 140 kDa. The two last were related to CryIA and Cry2A proteins families. The appendages showed to be formed by at least five different proteins. Two of them were glycosilated, and contained glucose and/or mannose in its carbohydrate portion. The typification of Bt1-88 by sequencing the gene involved in the flagellin production, clearly show that this bacterial strain had not identity with any of the 82 known serovarieties of B. thuringiensis. Therefore, Bt1-88 should be considered as a new serovariety of B. thuringiensis. Another aspect was to study if the PPIs could be used as carbon/nitrogen sources for germination of the spores of Bt1-88. Results showed however, no difference in the time of germination between the wild type strain, and two of its mutants lacking of PPI and appendages. Such mutants were obtained by using one specific transposon. Finally, it was demonstrated that the Cry proteins contained in the purified PPIs of Bt1-88, were not toxic for larvae of Manduca sexta and Aedes aegypti; therefore such proteins could have only a structural role.
Descripción : Bacillus thuringiensis produce en su fase estacionaria de crecimiento, pequeñas inclusiones proteicas intracelulares, llamadas comúnmente cristales, cuya forma y tamaño son diversas. Por su ubicación en un extremo de la espora, también se les conoce como inclusiones proteicas paraesporales (IPP’s). Tales estructuras están constituidas por proteínas que actúan cotra ciertos géneros de insectos plaga. Por lo tanto, dichas IPP’s se han usado a gran escala para producir insecticidas biológicos. Recientemente se describió una cepa atípica de B. thuringiensis denominada Bt2-56, cuya espora está unida a un filamento largo en cuyo extremo proximal se encuentra una IPP de forma cúbica. Más recientemente, y como resultado de la investigación que aquí se presenta, se informó de otra cepa de la misma especie denominada Bt1-88, la cual presenta una espora asociada a una pequeña IPP de forma plana y hexagonal, de la cual se desprenden seis apéndices. Las características tan peculiares de estas dos cepas permiten suponer la existencia de un nuevo fenotipo de B. thuringiensis, cuyas IPP’s están asociadas a uno o más apéndices. El presente trabajo tuvo como objetivo principal realizar nuevos estudios que permitan tener una imagen más completa de la cepa Bt1-88. Al respecto se encontró que su IPP de forma hexagonal mide 479±67.5 nm, y está compuesta por tres proteínas de 30, 60 y 140 kDa, perteneciendo las dos últimas a las familias proteicas CryIA y Cry2A. Los apéndices están constituidos por al menos cinco proteínas, dos de las cuales están glicosiladas, y su porción de carbohidratos contiene glucosa y/o manosa. La tipificación de Bt1-88 mediante la secuenciación del gen responsable de la producción de la flagelina, mostró que dicha cepa no muestra identidad con ninguna de las 82 serovariedades identificadas por esta técnica, lo que permite proponer a Bt1-88 como perteneciente a una nueva variedad de B. thuringiensis. Por otra parte, con objeto de conocer si existe algún tipo de participación de las IPP’s y de los apéndices en la germinación de las esporas de Bt1-88, se obtuvieron mutantes carentes de tales estructuras, mediante el uso de transposones. Tales mutantes no mostraron afectación alguna en su tiempo de germinación, lo que sugiere que las IPP’s no son utilizadas como fuente de carbono y nitrógeno por la nueva célula vegetativa que emerge de la espora germinada. Finalmente, los bioensayos realizados con las IPP’s purificadas, mostraron que sus proteínas Cry no poseen efecto tóxico contra insectos plaga modelo como Manduca sexta y Aedes aegpyti, por lo que puede pensarse que su función debe ser sólo de tipo estructural.
URI : http://www.repositoriodigital.ipn.mx/handle/123456789/8939
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