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Título : Proteína de choque térmico de 60kDa de Klebsiella pneumoniae en la apoptosis
Autor : DRA. DOMÍNGUEZ LÓPEZ, MARÍA LILIA
M. en C. ORTEGA ORTEGA, YOLANDA
Palabras clave : choque térmico
Klebsiella pneumoniae
apoptosis
Fecha de publicación : 20-jun-2011
Resumen : The heat shock proteins (HSP) are highly conserved macromolecules that are induced in prokaryotes and eukaryotes cells in response to physiological and environmental stress. It has been shown that HSP may have antiapoptotic function. It has been shown that the GroEL of E. coli protects against UV radiation-induced apoptosis in a human keratinocyte cell line (HaCaT). Our working group has reported humoral and cellular immune response to 60 kDa enterobacterial heat shock protein in spondyloarthropathies patients and healthy subjects. Recently, we observed protective effect of these proteins in apoptosis induced with dexamethasone, ursolic acid (UA) and H2O2 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects. Therefore, in this paper we analyzed the protective effect of HSP60 K. pneumoniae (HSP60Kp) in UA-induced apoptosis in primary cultured of synovial fibroblasts from BALB/c healthy mouse and evaluate whether this effect occurs through the expression of anti-apoptotic proteins that; Bcl-2, Bclx / L, cIAP-1, cIAP-2 and cFLIP. The primary culture of synovial fibroblasts from BALB/c mouse of 4-6 weeks old, was obtained by mechanical and enzymatic digestion and was characterized morphologically and phenotypically with positive markers for CD90 (Thy-1), vimetin, ICAM- 1 and negative for CD14. The results indicated a culture with a purity of 97.37% of fibroblasts. Analysis of apoptotic cells was performed by SubG0 peak in the flow cytometer. Induction of apoptosis in primary cultured synovial fibroblasts was made in the presence of 15 μg of AU, the cultures were incubated at 37 °C for 24 h. To evaluate the protective effect of enterobacterial protein, synovial fibroblasts were incubated 1 h before the addition of AU, with 0.1μg, 10 μg 1 μg of HSP60Kp. All assays included control without AU and with each protein tested concentration. The percentage of apoptotic cells obtained with AU (35.55%), decreased significantly to 30.44%, 27.02% and 23.20% respectively when fibroblasts were pre-incubated with the HSP60Kp. To assess whether the protective effect of HSP60Kp in the AU induced apoptosis in fibroblasts culture, was carried out by anti-apoptotic genes, we evaluated the expression of the messenger of the Bcl-2, Bclx/L, cIAP-1, cIAP-2 and cFLIP genes by RT-PCR. The results of the semiquantitative analysis after 6h of incubation showed a significant increase in the expression of Bcl-2 when HSP60Kp, AU and the AU plus HSP60Kp were added to the cell culture separately. cIAP1 gene expression was similar in the controls without AU and with the protein. In cultures containing AU the expression of this gene decreased significantly, more than half the expression that increased significantly (p <0.05) when the cells were incubated with the protein and after induced apoptosis with the AU. Similar results were observed in the expression of cIAP2 gene. cFLIP gene was expressed at basal level in the control of cells without inductor, similar to that observed with HSP60Kp expression, that decreased significantly with the AU but did not increase with the protein and the AU. These results suggest a protective effect of K. pneumoniae HSP60 in the AU induced apoptosis in fibroblasts cultures from BALB/c mouse and this effect may be modulated by the expression of Bcl-2, cIAP1 and cIAP2 genes.
Descripción : Las proteínas de choque térmico (HSP) son macromoléculas altamente conservadas que se inducen en células procariontas y eucariontas en respuesta al estrés fisiológico y ambiental. Se ha reportado que las HSP pueden tener función antiapoptótica. Se ha demostrado que la GroEL de E. coli protege de la apoptosis inducida con radiación UV a una línea celular de queratinocitos humanos (HaCaT). Nuestro grupo de trabajo ha reportado respuesta inmune humoral y celular hacia proteínas de choque térmico de 60 kDa (HSP60) enterobacterianas en pacientes con espondiloartropatías y sujetos sanos. Recientemente, hemos observado un efecto protector de estas proteínas en la apoptosis inducida con dexametasona (DXM), ácido ursólico (AU) y H2O2, en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de sujetos sanos. Por lo anterior, en este trabajo analizamos el efecto protector de la HSP60 de K. pneumoniae (HSP60Kp) en la apoptosis inducida con AU en cultivo primario de fibroblastos sinoviales de ratón BALB/c sano y evaluamos si este efecto se lleva a cabo a través de la expresión de proteínas anti-apoptóticas como; Bcl-2, Bclx/L, cIAP-1, cIAP-2 y cFLIP. El cultivo primario de fibroblastos sinoviales de ratón BALB/c sano de 4-6 semanas de edad, se obtuvo por disgregación mecánica-enzimática, se caracterizó morfológica y fenotípicamente con los marcadores positivos para el CD90 (Thy-1), vimetina, ICAM-1 y negativo para el CD14. Los resultados indicaron una pureza del cultivo con un 97.4% de fibroblastos. El análisis de las células apoptóticas se realizó por pico SubG0 en un citómetro de flujo. La inducción de apoptosis en el cultivo primario de fibroblastos sinoviales se realizó en presencia de 15μg de AU, los cultivos se incubaron a 37°C durante 24h. Para evaluar el efecto protector de la proteína enterobacteriana, los fibroblastos sinoviales se incubaron 1h previa a la adición de AU, con 0.1μg, 1μg y 10μg de la HSP60Kp, en todos los ensayos se incluyeron los testigos de las células sin AU y con cada una de las concentraciones probadas de la proteína. El porcentaje de células apoptóticas obtenido con AU (35.55%), disminuyó significativamente a 30.44%, 27.02% y 23.20%, respectivamente cuando los fibroblastos se pre incubaron con la HSP60Kp. Para evaluar si el efecto protector de la HSP60Kp en la apoptosis inducida con AU en el cultivo de fibroblastos se llevó a cabo a través de genes anti-apoptóticos. Se evaluó la expresión del mensajero de los genes Bcl-2, Bclx/L, cIAP-1, cIAP-2 y cFLIP por la técnica de RT-PCR. Los resultados del análisis semicuantitativo mostraron a las 6h de incubación un incremento en la expresión de Bcl-2 cuando a los cultivo celulares se les adicionó por separado, la HSP60Kp, el AU y la HSP60Kp más el AU. La expresión del gen cIAP1 fue similar para el testigo y para el cultivo con la proteína, en los cultivos que contenían el AU la expresión de este gen disminuyó significativamente a más de la mitad, la cual aumentó en forma significativa (p<0.05) cuando las células se incubaron con la proteína y después se les indujo apoptosis con el AU. Resultados similares se observaron con la expresión del gen cIAP2. El gen cFLIP se expresó en forma basal en el testigo de células sin inductor, que fue similar a lo observado con la HSP60Kp, expresión que disminuyó de forma significativa con el AU pero no aumentó con la proteína y con el AU. Los resultados sugieren un efecto protector de la HSP60 de K. pneumoniae en la apoptosis inducida con AU en el cultivo de fibroblastos sinoviales de ratón BALB/c. Este efecto parece ser modulado por los genes Bcl-2, cIAP1 y cIAP2.
URI : http://www.repositoriodigital.ipn.mx/handle/123456789/8911
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