Herramientas para el mejoramiento genético de S. violacensniger YCED-9 enfocadas a la producción de metabolitos secundarios

Abstract

El objetivo en el presente trabajo fue diseñar herramientas moleculares que posteriormente puedan ser aplicadas para la identificación de genes involucrados en la biosíntesis de guanidilfungina por S violaceusniger YCED-9. Para ello, se exploraron diferentes estrategias experimentales. La primera estrategia consistió en buscar un método de transformación que pudiera ser aplicada a la cepa bajo estudio. Para lo cual se exploraron diferentes técnicas de transformación. En primer lugar mediante conjugación, en este experimento se probaron diferentes temperaturas de incubación (un intervalo de 50 a 65oC) para inducir la germinación de las esporas e inhibir el posible sistema de restricción presente en la cepa. Sin embargo, no se obtuvieron transformantes. Otro de los métodos utilizados fue la electroporación, explorandose diferentes parámetros clave, como son el voltaje aplicado, esporas frescas, esporas frescas y germinadas. Sin lograrse obtener transformantes. Es por eso, que se optó por explorar otros métodos como la biobalística, en este caso también se analizaron los parámetros clave como la distancia del disparo, la concentración de ADN y el tiempo de crecimiento. Con este método se logro la obtención de transformantes con un plásmido de replicación autónoma y con un plásmido de integración. Se encontró que los parámetros variados si son muy importantes ya que se obtuvieron mayor número a los 9 cm cuando la concertación de ADN fue mayor. Por otro lado, mediante PCR se amplificaron secuencias de ADN de genes involucrados en la biosíntesis de guanidilfungina. Para esto se utilizaron ¨primers¨ previamente diseñados por Ayuso-Sacido, los cuales amplifican de forma especifica una acil tranferasa (AT), un dominio presente en enzimas PKS I. El resultado es una secuencia de 1200 pb. Posteriormente se hizo un análisis de secuencia 3 clonas, a las que se denominó pAYU5, pAYU10, y pAYU11 las cuales resultaron ser diferentes. Se encontró que pAYU5 y pAYU10 presentaron un mayor porcentaje de similitud a PKS I de pimaricina, anfotericina y nistatina, mientras que pAYU11 presenta mayor porcentaje de similitud a compuestos del tipo ansa.