Desarrollo de sondas para la detección de Chattonella spp. (Raphidophyceae) mediante la hibridación fluorescente in situ.

Abstract

El género Chattonella es un grupo de microalgas que poseen metabolitos secundarios tóxicos que afectan principalmente a los peces. Ya que carecen de una estructura rígida que las proteja, son frágiles a los métodos tradicionales de preservación y fijación. Aunado a ello, muchas de sus características morfológicas cambian bajo condiciones de estrés o con las condiciones de cultivo, dificultando su identificación por medio de la microscopía de luz. Una identificación más precisa se logra con ayuda de técnicas moleculares, mediante el diseño de sondas que permitan el reconocimiento de regiones específicas de ARNr; estas sondas unidas a un marcador fluorescente permiten una identificación más fácil mediante la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH), proveyendo de una herramienta útil para el monitoreo de florecimientos algales nocivos (FAN) de especies de Chattonella. Debido a esta problemática se busca desarrollar sondas moleculares para la cuantificación e identificación a nivel de especie de cepas de Chattonella, mediante microscopía de fluorescencia. Así se utilizaron las cepas CMPV-1, COPV-1 y CSNAV-1 aisladas del Golfo de California, además se probaron cepas aisladas provenientes de Japón y EUA. Para determinar cuál es el fijador más adecuado para el FISH se probaron los fijadores: glutaraldehído, paraformaldehído, la combinación de ambos y alcohol salino. Para evaluar la lisis causada por efecto de la fijación, se contaron células antes y después de la fijación. Las sondas se diseñaron a partir de secuencias de la región 5.8S, ITS1 y SSU del ARNr de cepas aisladas del Golfo de California, para poder diferenciar entre Chattonella subsalsa y Chattonella marina. El paraformaldehído a una concentración del 0.001% fue el fijador que presentó un menor efecto de lisis. Las densidades celulares para CMPV-1, COPV-2 y CSNAV-1 fueron de 11570, 11170 y 15750 cel mL-1 antes de ser fijadas (en vivo), y de 27750, 29400 y 59980 cel mL-1 fijadas con paraformaldehído, respectivamente. Las sondas Cm – 5.8S para C. marina y Cs-5.8S para C. subsalsa no lograron hibridar a ninguna de las condiciones probadas. A diferencia de las sondas Csub-ITS y Csub-SSU diseñadas para identificar a C. subsalsa para la cual sí hubo una señal de fluorescencia, pero estas no fueron específicas ya que también hibridaron con cepas de C. marina. La región ITS1-5.8S-ITS2 resulta no ser los suficiente variable como para desarrollar sondas específicas para diferenciar especies de Chattonella. Con base en lo anterior, se podría considerar el hacer el diseño de las sondas a partir de secuencias que solo incluyan la región ITS2 y también el dominio hipervariable D2 de la sub unidad grande (LSU) del ARN ribosomal ya que estas secuencias muestran una gran variabilidad que permite diferenciar entre especies de Chattonella.