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Título : ESTABILIDAD ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA M1 DEL VIRUS PANDÉMICO DE LA INFLUENZA A H1N1/2009: ANÁLISIS IN VITRO E IN SILICO
Autor : DRA. BENÍTEZ CARDOZA, CLAUDIA GUADALUPE
DR. ABSALOM ZAMORANO CARRILLO
MAYA MARTÍNEZ, ROBERTO CARLOS
Palabras clave : PROTEÍNA M1
INFLUENZA
VIRUS PANDÉMICO
A H1N1
Fecha de publicación : 13-jun-2011
Resumen : Influenza virus belongs the Orthomyxoviridae family. Its genome consists of eight segments of negative single strand RNA. The type A virus is the principal involved in global pandemics, due to genetic recombination between different viral types, called ―antigenic shifts." While specific changes in amino acids called ―antigenic drifts" are the main causes of seasonal regional epidemics, predominantly in winter periods. Viruses of the Orthomyxoviridae family possess a lipid bilayer envelope that anchors three transmembrane proteins, which have their active sites oriented toward the outside of the virion: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) and matrix protein (M) 2. On the other hand, M1 is the most abundant in the structure of the virus capsid. M1 is composed of 252 amino acids and nowadays the crystal structure of the first 164 amino acids has been solved, but not that of the whole polypeptide. They show a structure that contains 9 α-helices, numbered from H1 to H9. The three dimensional structure of the 88 remaining amino acids are so far unknown. M1 is a multifunctional protein involved in the formation of the virion when the virus is dormant and in the translocation of the ribonucleoprotein complex (vRNP) from the nucleus to the cytoplasm of the host during its replication cycle. All studies on the M1 protein have been focused on describing its structure and functions, yet little is known about its structural stability and conformational changes adopted for each of its functions. Therefore in this work, we studied the stability and plasticity in vitro and in silico of protein M1. Concerning in vitro studies, the gene codifying M1 was cloned in an expression vector. Subsequently, it was over-expressed in a bacterial system and the recombinant protein was purified to homogeneity at denaturing conditions. Regarding in silico studies, a model of the threedimensional structure of the whole polypeptide of M1 was constructed, and it was analysed by molecular dynamics simulations at three different temperatures (300, 400 and 500 K). M1 was generally very stable when tested in a molecular dynamics simulation at a temperature of 300 and 400 K, whereas at 500 K it lost mostly its native conformation Results from molecular dynamic simulations were also useful to understand conformational changes involved in the interaction of M1 with host membrane (H1, H4, H6 and H7) and its participation in various processes within the host cell nucleus as in the case of H6. We found that H6 is one of the most stable regions of M1 even after 20000 ps of simulation at a temperature of 500 K. Our results might explain how H1 and H4 might migrate from the hydrophobic core of the protein towards the solvent and consequently interact with the host membrane during influenza infection.
Descripción : El virus de la influenza pertenece a la familia Orthomyxoviridae. Su genoma está formado por ocho segmentos de RNA de cadena negativa (sencilla). El virus de tipo A es el principal involucrado en las pandemias a nivel mundial, debido a la recombinación genética entre distintos tipos virales, denominados cambios antigénicos (de sus siglas en inglés ―shifts‖). Mientras que cambios puntuales de aminoácidos, denominados deriva antigénica (de sus siglas en inglés ―drifts‖) son los principales causales de las epidemias regionales estacionales predominantemente en el periodo invernal. La familia Orthomyxoviridae se caracteriza por incluir virus envueltos por una bicapa lipídica que tiene ancladas tres proteínas transmembranales, las cuales tienen orientado su sitio activo hacia la parte externa del virión: Hemaglutinina (HA), Neuraminidasa (NA) y la proteína de matriz (M) 2. Por otro lado, la proteína de matriz (M) 1 es la más abundante en la estructura del virus ya que forma la cápside del mismo. M1 está compuesta por 252 aminoácidos y se ha dilucidado la estructura cristalográfica de los primeros 164 aminoácidos. Estos muestran una estructura que contiene 9 hélices-α, enumeradas desde H1 hasta H9. La estructura tridimensional de los 88 aminoácidos restantes hasta el momento se desconoce. M1 es una proteína multifuncional que participa en la formación estructural del virión y en la translocación del complejo ribonucleoproteico (vRNP) del núcleo al citoplasma del hospedero, durante su ciclo replicativo. Los principales estudios de M1 se han enfocado en describir su estructura y sus funciones, sin embargo poco se sabe sobre su estabilidad estructural y de los cambios conformacionales que adopta para realizar cada una de sus funciones. Por lo tanto, en este trabajo se realizó un estudio de la estabilidad y la plasticidad tanto in vitro como in silico de la proteína M1. En el caso de los estudios in vitro, el gen de M1 se clonó en un vector de expresión a partir del segmento 7, se sobre-expresó en un sistema bacteriano y se purificó hasta homogeneidad, bajo condiciones desnaturalizantes. En lo que respecta a los estudios in silico, se obtuvo un modelo de la proteína completa y se realizaron simulaciones de dinámica molecular a distintas temperaturas. La proteína M1 fue en general muy estable cuando se analizó en una simulación de la dinámica molecular a una temperatura de 300 y 400 K, caso que no ocurrió con la simulación de 500 K. Además en los estudios in silico, también fue analizada de manera específica la estabilidad y dinámica de aquellas estructuras de M1 a las que se les ha atribuido un fuerte impacto funcional, ya sea en la interacción con la membrana (H1, H4, H6 y H7) o en la participación en diversos II L.B.E. Roberto Carlos Maya Martínez 17 procesos dentro del núcleo de la célula huésped como es el caso de la H6. Donde encontramos que la H6 es la que tiene un elevado nivel de estabilidad después de una simulación de la dinámica molecular a una temperatura de 500 K. También pudimos determinar un posible mecanismo por el cual la H1 y H4 estarían exponiéndose al solvente para poder interaccionar con la membrana.
URI : http://www.repositoriodigital.ipn.mx/handle/123456789/12056
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